脫氫乙酸(DHA)是一種高效的防腐、防霉劑,在酸、堿條件下均有一定的抑菌能力,尤其對酵母、細菌、霉菌有較強的抑制能力,常用于果汁、醬菜、糕點、淀粉制品、肉制品、發酵豆制品、復合調味料等食品和食品添加劑防腐、防霉。但因其毒性及對人體健康的危害,對其含量的檢測日益受到人們的重視。本文針對DHA的多種檢測方法進行闡述,旨在為DHA的檢測研發提供一定的參考。 
 脫氫乙酸學名3-乙?;?6-甲基-脫(2)氫吡喃-2,4脫(3)氫二酮,是繼苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸酯類之后又一代新的廣譜食品防腐防霉劑,它基本不受pH的影響,抑菌能力很強,尤其對酵母、細菌、霉菌有較強的抑制能力,常用于果汁、醬菜、糕點、淀粉制品、肉制品、發酵豆制品、復合調味料等食品和食品添加劑防腐、防霉。工業上還用于飼料、日用化妝品、纖維制品、醫藥以及齒科材料的防腐。但是脫氫乙酸半數至死量大鼠口服為1000mg/kg體重,大量食用脫氫乙酸對人體健康將產生嚴重的危害。許多國家對脫氫乙酸在食品中的使用量都有明確的規定:日本規定其在食品中添加量不得超過0.5g/kg;美國規定其在食品中最高殘留限量為65mg/kg。我國《GB 2760-2011 食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中規定:脫氫乙酸可用于果汁、醬菜、糕點、淀粉制品、肉制品、發酵豆制品等幾類食品,最大使用量為0.3~1.0mg/kg。因而,準確地測定食品中脫氫乙酸的含量,有利于指導企業生產,規范企業行為;同時也有利于維護消費者權益,減少不良危害。 
 檢測食品中脫氫乙酸的國標方法有氣相色譜法、液相色譜法等,方法各有優缺點。本實驗在多種樣品前處理方法上進行改進,并相對應建立有效的氣相色譜、液相色譜、氣相色譜質譜聯用等檢測方法,為今后食品中脫氫乙酸的檢測研發提供一定的參考。 
 1、氣相色譜法 
 該方法是在GB/T 5009.121-2003《食品中脫氫乙酸的測定》標準方法上進行改進:將樣品酸化后,用乙醚提取脫氫乙酸后濃縮,用氣相色譜(附氫火焰離子化檢測器)進行分離測定,與標準系列比較定量。 
 1.1實驗部分 
 1.1.1儀器與主要試劑 
 氣相色譜儀:GC-17(附氫火焰離子化檢測器 FID),譜析科學儀器公司。 
 脫氫乙酸標準品:純度≥99.6%,購自美國。 
 乙醚:色譜純,重蒸。 
 丙酮:色譜純,重蒸。 
 脫氫乙酸標準工作溶液:準確稱取脫氫乙酸標準品50mg,以丙酮溶解定容于50mL容量瓶中,再以丙酮分別稀釋至1μg/mL、10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL 120μg/mL、160μg/mL 200μg/mL,配制標準工作溶液。 
 色譜條件: 
 色譜柱:DB-5毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm); 
 分流比:10:1,柱流速1.0mL/min 
 進樣口溫度:250℃、檢測器溫度:300℃、柱溫165℃; 
 氣流條件:氫氣50mL/min、空氣400mL/min、氮氣40mL/min。 
 應用上述色譜條件,脫氫乙酸標準品溶液進樣,色譜圖如下: 
 1.1.1樣品處理 
 稱取5~10g試樣(準確至0.0001g),加10mL飽和氯化鈉溶液,2mL鹽酸溶液(1+1)酸化,分別以50mL、20mL、20mL乙醚提取三次,合并乙醚層于100mL容量瓶中定容后,分別用20mL飽和氯化鈉溶液、50mL碳酸氫鈉溶液(10g/L)各洗滌一次,加10g無水硫酸鈉,室溫下放置30min,取50mL在60℃水浴下用旋轉蒸發儀濃縮至近干,用丙酮定容后供氣相色譜測定。 
 1.1方法討論 
 1.1.1色譜條件的選擇 
 脫氫乙酸用氣相色譜法測定,與其他同類功能的防腐劑如山梨酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸酯類都有很好的分離度,且在非極性柱、弱極性柱和極性柱中都有很好的響應值。但在實驗顯示,脫氫乙酸在非極性柱中因低柱溫有色譜峰拖尾現象,在極性柱中因柱流失有基線漂移現象,為使定性定量準確,選用了弱極性柱DB-5。 
 1.1.1線性關系 
 在本實驗條件下,脫氫乙酸標準工作液在0.5~100μg/mL范圍內與響應值峰面積有良好的線性關系,相關系數r=0.99995。脫氫乙酸的最低檢出濃度為0.2μg/mL。 
 1.1.1準確度與精密度 
 選用含脫氫乙酸的辣椒醬樣品,在樣品中添加不同濃度的脫氫乙酸標液,按本方法測定,每一濃度重復測定6次,取平均值,計算平均回收率及變異系數,結果見下表。實驗結果顯示,本方法回收率滿意,相對標準偏差范圍小于10%,重復性好,符合檢測要求。 
 加標濃度(mg/kg) 平均回收率(%) 精密度 RSD(%) 1.0 83.2 6.8    5.0 89.6 5.6   10.0 90.3 4.7    30.0 91.6 3.6     50.0 102.4 3.4 
 2、液相色譜法 
 該方法是在GB/T 23377-2009《食品中脫氫乙酸的測定 高效液相色譜法》標準方法上進行改進:用氫氧化鈉溶液提取試樣中的脫氫乙酸,經脫脂、去蛋白處理后,用高效液相色譜紫外檢測器測定,與標準系列比較定量。 
 2.1實驗部分 
 2.1.1儀器與主要試劑 
 液相色譜儀:LC-3000(二級管陣列檢測器 DAD),譜析科學儀器公司。 
 脫氫乙酸標準品:純度≥99.6%,國標公司。   甲醇:色譜純。 
 乙酸銨溶液(0.02mol/L):分析純,稱取1.54g乙酸銨用氨水(1+1)調節pH至9.0,加水至1000mL溶液,經0.45μm濾膜過濾。 
 2.1.2色譜條件 
 色譜柱:ECOSIL-C18柱 (5μm,250mm×4.6mm); 
 流動相:甲醇+0.02mol/L乙酸銨(5+95,v/v) 
 流速:1.0mL/min 
 柱溫:40℃ 
 檢測波長:293nm 
 應用上述色譜條件,脫氫乙酸標準品溶液進樣,色譜圖如下: 
 2.1.3樣品處理 
 稱取5~10g試樣(準確至0.0001g),加50mL水,用氫氧化鈉溶液(8g/L)調節pH至7.2,加入5mL乙酸鋅溶液(220g/L),5mL亞鐵氰化鉀溶液(106g/L),超聲提取40min,定容至100mL,靜置30min過0.45μm濾膜,供液相色譜測定。 
 2.2方法討論 
 2.2.1色譜條件選擇 
 在GB/T 23377-2009國標方法中,流動項的選擇為甲醇+0.02mol/L乙酸銨(10+90,v/v)。在實際樣品的檢測中,考慮到食品中其他添加劑對于脫氫乙酸檢測(如山梨酸、糖精鈉等)的影響,能過對不同比例流動相的實驗,發現流動相比例為甲醇+0.02mol/L乙酸銨(5+95,v/v)優于國標方法條件,結果見下表。 
 2.2.2線性關系 
 在本實驗條件下,脫氫乙酸標準工作液在0.5~100μg/mL范圍內與響應值峰面積有良好的線性關系,相關系數r=0.99999。脫氫乙酸的最低檢出濃度為0.1μg/mL。 
 2.2.3準確度與精密度 
 參照1.2.3,選用同一辣椒醬樣品,按本方法測定,做加標實驗,每一濃度重復測定6次,結果見下表。實驗結果顯示,本方法回收率滿意,相對標準偏差范圍小于10%,重復性好,符合檢測要求。 
 3、氣相色譜質譜聯用法 
 目前尚無氣相色譜質譜聯用測定食品中脫氫乙酸的國標方法,筆者是根據本實驗室進行實驗建立的方法:試樣經乙醚提取,用氣相色譜進行分離,特征離子峰進行定性定量。 
 3.1實驗部分 
 3.1.1儀器與主要試劑 
 氣質聯用儀:GCMS-7890A-5975C,美國安捷倫公司。 
 脫氫乙酸標準品:純度≥99.6%,購自美國。 
 正已烷:分析純。 
 乙醚:色譜純,重蒸。 
 脫氫乙酸標準工作溶液:準確稱取脫氫乙酸標準品50mg,以乙醚溶解定容于50mL容量瓶中,再以乙醚分別稀釋至1μg/mL、10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL 120μg/mL、160μg/mL 200μg/mL,配制標準工作溶液。 
 3.1.2色譜條件 
 載氣:高純氦氣(99.999%); 
 色譜柱:DB-5MS毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm); 
 柱流速:1.0 mL/min; 
 汽化室溫度:250℃、柱溫程序:初始溫度150℃,保持0.5min,以10℃/min速率升溫至180℃,保持6min。 
 3.1.3 質譜條件 
 傳輸線溫度:220℃;離子源溫度:200℃;離子化方式:EI;電子能量:70eV;延遲時間2.0 min;檢測方式:全掃描,質量范圍:m/z 25~300。 
 應用上述質譜條件,脫氫乙酸標準品溶液進樣,質譜圖如下: 
 3.2.1樣品處理 
 稱取5~10g試樣(準確至0.0001g),加35mL水、2mL氫氧化鈉溶液(20g/L),超聲提取20 min,用水定容至50mL,加10mL正己烷提取一次,棄去正己烷層,再加1mL鹽酸(1+1)酸化,準確加入10mL乙醚振搖5min,靜置10min,取上清液供質譜測定。 
 3.2方法討論 
 3.2.1質譜條件的選擇 
 根據脫氫乙酸在氣相色譜上的良好響應情況,用質譜測定時,仍選用的弱極性柱DB-5MS柱。檢測方式選擇全掃描、選擇離子掃描皆可,本文選擇了全掃描。 
 3.2.2線性關系 
 在本實驗條件下,脫氫乙酸標準工作液在0.5~100μg/mL范圍內與響應值峰面積有良好的線性關系,相關系數r=0.99997。脫氫乙酸的最低檢出濃度為0.2μg/mL。 
 3.2.3準確度與精密度 
 選用同一辣椒醬樣品,按本方法測定,做加標實驗,每一濃度重復測定6次,結果見下表。實驗結果顯示,本方法回收率滿意,相對標準偏差范圍小于10%,重復性好,符合檢測要求。 
 4、結論 
 本文探討的三種方法,分離度好,回收率較好,都是食品中脫氫乙酸含量的良好檢測方法。相比較而言,氣相色譜法與干擾物質的分離度好,但樣品前處理較復雜;液相色譜法樣品前處理簡便,特征峰定性較差;氣相色譜質譜聯用法樣品前處理較氣相色譜法簡便,定性較色譜更精準,但儀器設備價格昂貴難以推廣。